摘要目的：探讨血管内皮细胞构建的组织工程骨修复兔下颌骨缺损。方法：实验分为三组，A组兔成骨细胞(rabbitosteoblast,ROB)和血管内皮细胞(rabbitvascularendothelialcell,RVEC)复合外消旋聚乳酸（poly-DL-lacide,PDLLA），B组单纯成骨细胞复合PDLLA，C组单纯PDLLA组。修复兔下颌骨缺损，手术后4周、8周通过形态学、X-射线观察骨缺损修复及血管化情况。结果：A组骨组织形成与血管化程度均高于B组，在材料中心区可见有血管形成，越靠近血管成骨越多。X-射线观察，A组：骨缺损区阴影面积明显减小，材料植入区可见骨组织影像，B组：缺损面积减小，骨组织影像增加。中心区影像低于周围区域。C组：缺损区植入材料部分未见骨组织影像，周围可见骨痂形成影象。结论：复合血管内皮细胞与成骨细胞的细胞支架复合体无论在成骨还是血管化方面均好于单纯成骨细胞复合支架植入组。关键词：血管化修复缺损下颌骨体在组织工程骨缺损修复动物实验中理想的修复方式是使植入的种子细胞与支架复合体保持良好的血液供应，确保植入的组织工程骨可以体内成活。在本实验中切除部分兔下颌骨形成骨缺损，并将血管内皮细胞与成骨细胞联合培养复合于PDLLA上，植入到兔下颌骨缺损处，观察血管化组织工程骨修复兔下颌骨缺损情况。材料与方法1材料日本大耳白兔12只（解放军总医院实验动物中心提供），胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、DMEM高糖培养基（美国sigma公司），胎牛血清（澳大利亚），6孔细胞培养板、75cm2培养瓶（美国Costar公司），PDLLA（山东医疗器械研究所）。2成骨细胞与血管内皮细胞体外培养、冻存复苏与传代根据本实验前期工作，取出生24h以内乳兔四肢长骨进行成骨细胞原代培养，双侧肾皮质进行血管内皮细胞原代培养，并传代。将传至第三代成骨细胞和血管内皮细胞用0.25%胰酶消化，收集、离心并移至冻存管中，沉淀加含保护液的培养基，按顺序降温至液氮，冻存七天后复苏。将冻存管置于37℃温水中使冻存细胞在1分钟之内融化，将细胞悬液吸到离心管中。1000rpm离心10分钟，弃去上清液，加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养，观察细胞生长情况并传代、扩增备用。3支架处理及分组PDLLA制作成体积为15×10×7mm3长方体状，75%酒精内浸泡24h，入三蒸水中72h。支架置入瓶中加入配制的Ⅰ型胶原溶液，负压抽真空。取出支架后自然干燥，环氧乙烷灭菌待用，将成骨细胞与血管内皮细胞以2：1的体外共培养比例接种与支架上。实验分组为：A组ROB+RVEC/PDLLA；B组ROB/PDLLA；C组PDLLA4实验动物、植入材料、植入部位分组（表1） 表1实验动物、植入材料、植入部位动物编号左侧下颌骨右侧下颌骨1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12ACBBAC12只日本大耳白兔分成三组并编号，每只大耳白兔两侧下颌骨按上表分别用三组实验材料修复。5日本大耳白兔下颌骨缺损模型手术严格无菌操作。10%水合氯醛耳缘静脉麻醉，按3ml/kg体重计算。选择兔下颌骨下缘切口，仔细剥离并去除下颌骨内外壁之骨膜。保留牙槽突，形成约15×10×7mm骨缺损。分别将A组ROB+RVEC/PDLLA、B组ROB/PDLLA、C组PDLLA，植入缺损处，将细胞支架复合体嵌入骨缺损处与骨创缘紧密接触，缝线与周围骨膜肌肉形成坚固固定，缝合创口。术后肌住青霉素40万IU，连续三天。6下颌骨修复术后大体观察及组织学观察12只动物分两侧下颌骨共24例，其中A组修复9例，B组9例，C组6例，术后4周、8周两个时间点处死动物并取材。4周时处死编号
1、2、3、7、10号动物，A组修复4例，B组4例，C组2例。8周时处死编号4、5、6、8、9、11、12号动物，A组修复5例，B组5例，C组4例。观察植入物成骨、降解情况、下颌骨缺损修复后大小、外形色泽等。采集下颌骨缺损两端正常组织在内的植入材料骨块，10%中性福尔马林固定，50%甲酸脱钙，常规石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察。7X-线观察分别于术后4周、8周应用口腔数字影像系统采集缺损区X线影像，观察下颌骨缺损修复情况。结果1术后大体观察术后4周观察，A组可见复合体稳固的位于缺损区，植入物硬度高于植入初期复合体，刚刚处于骨化初期。B组与A组大体情况类似，C组可见支架材料质地较软。术后8周A组可见缺损区明显减小，植入物与宿主骨之间为骨性连接，具备一定硬度，B组所形成骨的质量及硬度不及A组，支架中心区可见白色降解产物，成胶冻样，C组支架材料为肌肉包裹，未见骨组织形成。2组织学观察术后4周，A组纤维结缔组织及血管形成明显增多，支架材料逐渐降解吸收，以C组降解吸收速度为快。A组可见血管周围有新生软骨组织形成，可见成骨细胞位于骨样组织周围。在材料中心区可见有血管形成，越靠近血管成骨越多。B组可见新骨形成，血管自周围组织长入，故材料周围可见毛细血管结构，材料中央血管化程度不高。C组修复材料内充满纤维结缔组织，无明显骨组织形成。术后8周，A组修复侧血管化成熟程度强于4周时，移植材料的一部分已为新骨所代替，组织学观察已经有板层骨形成，呈深蓝色。材料降解吸收较快（图1）。B组材料植入组，血管化进程只在材料边缘出现，材料吸收成独立的小岛，在中央区域可见均质样降解物质，与骨小岛交织在一起（图2）。C组单纯材料修复组，在材料内部仍然未见有骨组织形成，可见材料降解明显（图3）。3X-线观察结果术后4周兔下颌骨缺损修复情况，A组：材料内部可见高密度影像，有明显的骨组织形成，但缺损区植入物与宿主骨之间仍可见明显界限，修复材料密度低于正常骨组织影像。B组：材料内部也可见高密度影像，可见有骨组织影像，但骨密度影明显低于正常骨组织。C组：骨缺损区无明显改变，阴影区也未见骨组织影像。术后8周兔下颌骨缺损修复情况，A组：骨缺损区阴影面积明显减小，材料植入区可见骨组织影像，仍低于正常骨组织密度，但较4周时影像密度明显增高（图4），B组：缺损面积减小，骨组织影像增加。中心区影像低于周围区域（图5），C组：缺损面积有所减小，但缺损区植入材料部分未见骨组织影像，周围可见骨痂形成形象（图6）。讨论1、构建血管化组织工程骨策略骨组织缺损的修复中，临床常用的方法主要是取自体骨修复，但是自体骨移植需要开辟第二手术野给患者带来更大痛苦，同时，还存在感染和移植骨吸收的风险，难以准确的符合缺损区的形状使之受到限制。组织工程学技术的应用，为骨缺损开辟了一个新道路，但受组织工程骨植入后成活的影响所建缺损模型体积较小，因此保证植入的组织工程骨在体内能够形成良好的血管化骨瓣是面临的关键问题。解决该问题目前有三种方法已在实验中应用
（1）在组织工程骨构建中复合血管生长刺激因子，
（2）预构皮瓣与组织工程骨，
（3）将血管内皮细胞与成骨细胞联合培养构建血管化组织工程骨。VEGF是目前发现促血管形成作用最强的一类细胞因子，主要由内皮细胞分泌。将VEGF以缓释微囊形式合成到支架材料中，或以质粒转染到骨髓基质干细胞中修复牙槽嵴裂，可以看到在植入物周围有大量血管形成。Yoshida等将rhBMP-2与羟基磷灰石、Ⅰ型胶原复合，修复兔下颌骨的缺损，取得较好的效果。但生长因子的应用，将面临着一个重要问题即体内植入后是否可以持久的释放，形成一个良好的缓释系统，促进骨的形成；另一方面，很多患者患恶性肿瘤手术切除后通常要进行放射治疗，放疗后周围组织对骨形成蛋白等促骨生成因子的反应将大大减弱。因此生长因子的应有同样有赖于体内血供的充分。
2、血管内皮细胞在组织工程骨中的应用在本实验前期工作中，将血管内皮细胞与成骨细胞共培养后复合支架材料，并埋植于兔背阔肌初步预构出血管化组织工程骨肌皮瓣。基于前期实验，本研究将血管内皮细胞和成骨细胞与支架复合修复兔下颌骨缺损。实验可以发现复合血管内皮细胞修复下颌骨缺损侧8周时，支架材料骨化程度、血管化程度均较高，支架材料部分为新骨所代替，支架材料吸收和新骨形成旺盛，在血管周围尤为明显。单纯成骨细胞修复侧骨化情况、血管化程度与联合培养侧相比有明显差距。支架材料复合成骨细胞植入体内后，其血管化方式主要是自体毛细血管束伴随纤维肉芽组织长入移植物内，本实验结果显示，A组移植物中央部位血管化明显高于B组是因为周围组织的血管组织的长入与支架内部血管内皮细胞相沟通的结果。有学者指出，从理论上讲血管内皮细胞能够促进血管的生长，但是植入体内的血管内皮细胞与种子细胞一样需要及时的血液供应以保证成活，这与本实验的结果相类似。而组织工程骨移植术后4周已经有血管化，术后4～8周为血管化加速阶段，8周使血管化已经处于相对平稳阶段，这与国内外学者近期研究结果基本相同。通过研究可以看到，血管内皮细胞作为种子细胞参与骨组织工程构建，可以在组织工程骨的构建与修复中起到促血管化作用。参考文献
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