Wilson病患者血清MMP-1、TIMP-1的检测及其临床应用价值薛本春，韩咏竹,杨任民(安徽中医学院神经病学研究所附属医院,安徽合肥 23061)
摘要:目的 探讨Wilson病(WD)患者血清基质金属蛋白酶-1(MMP-1)和金属蛋白酶一1组织抑制因子(TIMP-1)检测的临床应用价值.方法 选取WD患者61例、正常对照20例,分别采用双抗体夹心ABC-EIASA法检测血清MMP-1、TIMP-1,放射免疫法检测血清HA、LN、PClI、C-IV,比较两组血清指标的差异,并将WD患者血清MMP-1、TIMP-1及TIMP-1/MMP-1的比值与HA、LN、C IV等传统肝纤维化指标进行相关性分析,同时结合WD临床分型、肝脏B超分型及病理分期进行各型、各期比较及相关性研究.结果 WD患者血清MMP一1较正常对照明显减低(P结节型组及肝纤维化晚期组患者血清MMP.1最低,而血清TIMP一1及TIMP 1/MMP.1的比值最高;
血清MMP-1与传统肝纤维化指标、WD临床及B超分型呈负相关,而血清TIMP.1及TIMP.1/MMP.1的比值则与之呈正相关.结论 血清MMP.1、TIMP一1及TIMP 1/MMP 1的比值是反映WD肝纤维化程度的较好指标,这些指标水平与WD临床及B超分型有很好的相关性,特别是血清TIMP-1及TIMP一1/MMP一1的比值对动态观察WD肝纤维化演变过程、判断肝纤维化程度具有重要的临床意义.
关键词:Wilson病;肝纤维化;MMP.1;TIMP-1
Clinical value of checking serum MMP.1 andTIMP.1 in patients with Wilson~diseaseXUE Ben chun.HAN Yong.zhu.YANG Ren rain(Institute ofNeurology,Affiliated Hospital ofAnhui Colege of Traditional Chinese Medicine,Hefei 230061 China)Abstract:Aim To explore the clinical value of checking se/um MMP一1 and TIMP一1 in patients with Wilsong disease(WD).MethodsWe selected 61 patients with WD as study group,20 healthy people as control group.In both groups,we checked selum MMP一1 andTIMP-l by ELISA,selum HA,LN,PClI and C一1V by radioimmunoassay(RIA).In study group,selum MMP-1,TIMP-1 and the ratio ofTIMP--1/MMP一1 were compared with those in the control group and analyzed respectively in correlation with those traditional hepatic fi-broindexes such as serum HA,LN,C-IV,etc.Furthermore,those new hepatic fibroindexes were also compared in the groups of differentclinical type,B-ultrasonic wave type and pathological stage of the liver and analyzed in corelation with them corespondingly.ResultsThe level of se/um MMP-1 was significantly lower than that in control group(P<0.01)while the level of selum TIMP-1 and the ratio ofTIMP-1/MMP-1 were significantly higher(P<0.01);
In the group of brain'liver type,nodule type and the late stage of the hepatic fibro-sis.the level of selum MMP一1 was the lowest while the level of selum TIMP一1 and the ratio of TIMP一1/MMP-1 were the highest.Thelevel of selum MMP一1 was negatively corelated with those traditional hepatic fibroindexes,clinical types and B-ultrasonic wave types,while the level of selum TIMP一1 and the ratio of TIMP一1/MMP一1 were positively corelated with them.Conclusion Serum MMP-1.
TIMP一1 and the ratio of TIMP-1/MMP-1 were good indexes that can reflect the degree of hepatic fibrosis in WD.These indexes had bettercorelation with the clinical types and B-ultrasonic wave types,especially serum TIMP一1 and the ratio of TIMP一1/MMP一1 took an impor-tant part in measuring the degree of hepatic fibrosis and observing the variable course of hepatic fibrosis in WD.
Key words:Wilsong disease;hepatic fibrosis:Matrix metalloproteinase-1;
Tissue inhibitors of metalloproteinase-1Wilson病(WD),是一种常染色体隐性遗传性铜代谢障碍疾病.由于铜代谢障碍造成WD患者体内过量铜沉积,产生以肝、脑等为主的全身脏器的慢性损害 J.肝纤维化是肝脏受到慢性损害时细胞外基质(ECM)可逆性沉积的创伤愈合过程,是肝脏慢性损害发展至肝硬化的必经阶段 .临床病理证实:肝纤维化或肝硬化几乎是每一个WD患者肝脏的主要病理改变 J.多年来我院一直致力于寻找血清学指标来监测WD肝纤维化发展过程,前期研究主要集中在透明质酸(HA),层粘蛋白(LN),IV型胶原(C IV)等指标,研究表明:这些指标主要反映肝脏ECM的合成,因此对判断WD肝纤维化程度具有一定的临床应用价值 .近年来,随着对ECM降解机制研究的深入,认为ECM降解不足,特别是后期ECM降解减少是导致WD发生肝纤维化或肝硬化的主要机制 .目前已知:基质金属蛋白酶-1(MMP-1)是参与ECM降解的主要酶,在ECM降解过程中起主要作用,而金属蛋白酶一1组织抑制因子(TIMP一1)则主要通过对MMP 1活性抑制来阻止ECM降解.本研究通过对WD患者血清MMP一1、TIMP一1等指标的检测,并结合不同的肝纤维化病理分期、肝脏B超类型及临床类型进行分析,研究,来探讨该血清指标检测的临床应用价值.
1 对象与方法
1.1 研究对象1.1.1 WD组 61例WD患者来自安徽中医学院神经病学研究所附属医院2005年9月-2006年4月期间住院患者,均为未经驱铜治疗的初诊患者或近半年以上未正规驱铜治疗的复诊患者,所有病例均符合WD诊断标准 .其中男34例,女27例;年龄8-32岁,平均(22.7±7.6)岁;病程6月~4年不等,平均(24.2±13.2)月.
1.1.2 对照组 同期选择20例无血缘关系的健康志愿者作为正常对照组,其中男11例,女9例,年龄10~29岁,平均(21.5±7.8)岁.所有志愿者血清铜、铜蓝蛋白及铜氧化酶等铜代谢检查均正常,并排除病毒性肝炎等其它相关疾病.
WD组与正常对照组年龄、性别均无统计学差异(P>0.05).
1.2 研究方法
1.2.1 血清标本留取及检测 61例WD患者及20例正常对照分别于清晨采取空服静脉血6 ml,血经低速冷冻离心后取血清约3 m1等分置于6个离心管中,-20℃冰箱保存.血清MMP-1、TIMP.1测定采用双抗体夹心ABC-EIASA法,试剂盒由美国RB公司提供;血清HA、LN、PCⅢ、C-IV测定采用放射免疫法(RIA),试剂盒由上海海研医学生物技术有限公司提供.各指标测定均严格按照试剂盒说明书进行.
1.2.2 肝标本留取及肝组织中MMP-1、TIMP-1阳性表达细胞的计数方法 6例WD脾切除术患者及1例外伤性肝肝脾破裂患者,分别于肝左叶下缘取少许肝组织标本,取材后立即固定于10%福尔马林溶液中,常规石蜡包埋切片,HE染色,参照Scheuer j肝纤维化分期标准,将这6例肝标本纤维化程度分为中期组2例,晚期组4例.对阳性结果分别作半定量分析,即取4个角及中央共5个200×视野,计数每200×视野中阳性细胞的平均值.MMP-1、TIMP-1免疫组化试剂盒分别由武汉博士德及福州迈新生物技术有限公司提供.
1.2.3 WD临床分型 采用杨任民教授的WD分型标准,根据损害脏器的重点及临床表现的不同,将61例WD患者分为脑型组(17例)、肝型组(16例)、脑-内脏型组(28例).
1、2、4 WD肝脏B超分型 采用王兴族等对WD肝脏B超分型方法,即按照肝损害在B超上表现的轻重不同,将61例WD患者分为脂肪浸润型(5例)、光点闪烁型(6例)岩层征型(17例)、树枝光带型(12例)、结节型(21例).
1.3 统计学方法
所有数据均用 -l-s表示,采用SPSS11.5软件进行统计学处理,成组资料比较采用双侧t检验、多个样本均数之间的两两比较采用q检验、相关分析采用partial Cotorelation分析.
2 结果
2.1 WD组与正常对照组肝纤维化血清指标的比较 见表1.由表1所见:WD组血清TIMP-1、HA、LN、PCⅢ、C-IV较正常对照明显增高;而血清MMP.1较正常对照明显减低,差异有显着统计学意义(P<0.01).
2.2 WD血清MMP-1、TIMP-1等指标与I-IA等传统肝纤维化血清指标的相关性 见表2.由表2所见血清MMP-1与HA、LN、PCⅢ、C-IV呈负相关,并且与纤维化程度相关性较好的HA、LN两个指标相关性也较好(P<0.O1);而血清TI~IP.
及TIMP-1/MMP-1的比值与HA、LN、PCⅢ、C.IV成正相关,并且血清TIMP-1及TIMP-1/MMP-1的比值与HA、LN两个指标也相关性较好(P<0.O1).
2.3 WD血清及肝组织中MMP-1、TIMP-1表达水平与肝纤维化程度的关系 见表3.由表3所见,WD肝纤维化晚期组患者,其肝组织中MMP-1阳性细胞表达较中期组减少,而TIMP-1阳性细胞表达较中期组明显增多,并且血清MMP-1、TIMP-1水平高低与其肝组织中MMP-1、TIMP-1表达水平高低相一致.
2.4 WD血清MMP-1、TIMP·1等指标与肝脏B超分型的相关性 见表4.由表4所见:结节型组血清MMP-1最低、而血清TII~IP-1及血清TIMP-1/MMP-1的比值最高;脂肪浸润型组血清MMP-1最高、而血清TIMP-1及血清TIMP-1/MMP.1的比值最低;
结节型组血清MMP.1、TII~IP.1及TIMP.1/MMP.1的比值与其它各型组比较有显着性差异(P0.05).按照B超表现上肝损害从轻到重,血清I~IMP-1与B超分型之间呈负相关,相关系数为-0.196,血清TIMP-1及TII~IP-1/MMP-1的比值与B超分型之间呈正相关,相关系数分别为0.218、0.256(P<0.01).
2.5 WD血清MMP-1、TIMP-1等指标与临床表型的相关性见表5.由表5所见:脑型组血清I~IMP.1最高,肝型组次之,脑-内脏型组最低;
脑.内脏型组血清TII-IP.1及血清TIMP-I/MMP-1的比值在最高,肝型组次之,脑型组最低.各组间血清MMP-1、TIMP-1技TIMP.1/MMP-1的比值比较有显着性差异(P<0.01).按照临床表型肝损害从轻到重,血清MMP-1水平与临床表型呈负相关,相关系数为-0.4265,而血清TIMP-1水平及血清TIMP-1/MMP-1的比值与临床表型呈正相关,相关系数分别为0.5062,0.7850(P<0.01)
3 讨论
WD肝纤维化是代谢性肝纤维化的一种,是由于铜离子排泄障碍而在肝内缓慢蓄积,通过激活肝星状细胞,引起肝损伤修复时ECM的合成与降解不平衡,并最终导致ECM在肝内不断沉积的病理过程.近年来,随着对ECM降解机制研究的深入,认为ECM降解不足,特别是后期ECM降解明显减低是导致WD发生肝纤维化或肝硬化的主要机制".目前已知:参与ECM降解的酶主要为基质金属蛋白酶(MMPs)和金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs),MMP-1作为MMPs的基本型,在肝内主要由肝星状细胞、肝细胞、Kupfer细胞、内皮细胞产生,能够特异性地降解肝纤维组织内的I、Ⅲ型胶原等ECM成分,故在肝内ECM降解代谢中发挥着重要作用.而MMP-1的活性主要受体内TIMP-1抑制,TIMP-1通过与有活性的MMP.1以1:1的分子比例非共价结合,从而特异性地抑制MMP.1对ECM的降解活性 J.因此MMP-1、TIMP-1是反映WD肝纤维降解代谢的指标,TIMP-1/MMP-1的比值可以大致了解体内TIMP一1对MMP一1的抑制程度,进而可间接反映MMP.1对肝纤维化组织中ECM的降解活性.
本研究中61例WD患者血清MMP-1较正常对照明显减低(P乙肝肝硬化患者,其肝组织中TIMP.1表达水平较正常升高4.1倍,而MMP一1表达水平较正常下降60%~70%研究结果 ' 较接近,表明WD患者体内普遍存在着对ECM的降解不足,这可能与WD患者起病隐袭,发病年龄小,较早发生肝纤维化或肝硬化有关.本研究进一步对WD不同肝纤维化病理分期肝组织中MMP-1、TIMP-1表达水平及相应血清MMP-1、TIMP-1测定结果表明:血清MMP-1、TIMP-1水平与其肝组织中MMP-1、TIMP.1表达水平相一致,即随着WD肝纤维化程度的加重,肝组织中TIMP-1表达水平逐渐增高,MMP一1表达水平逐渐下降,相应地血清TIMP-1水平也逐渐增高,血清MMP-1水平也逐渐下降.此结果与Boeker等对慢性病毒性肝炎患者不同病理时期肝组织中MMP-1、TIMP-1表达水平高低与其血清MMP.1、TIMP-1水平高低相一致研究结果 相似,由此进一步说明血清MMP.1、TIMP-1可以用来反映WD肝纤维化程度.此外,本研究中WD患者血清MMP-1、TIMP-1及TIMP-1/MMP.1的比值与HA、LN等传统肝纤维化指标具有较好的相关性,既往研究已证实:血清HA、LN等指标能够较好地反映WD肝纤维增生及肝纤维化程度 j,因此同样可以证明:血清MMP-1、TIMP-1及TIMP.1/MMP.1的比值能够较好地评价WD肝纤维化程度,而血清TIM-1及TIMP-1/MMP-1的比值可能与HA、LN具有相似的诊断价值 .
本研究通过对不同肝脏B超类型的WD患者血清中MMP-1、TIMP-1的比较及与肝脏B超分型相关性分析,表明:
随着WD肝损害在B超表现上的加重,血清TIMP-1水平逐渐增高,而血清MMP-1水平逐渐减低,相应地血清TIMP-1/MMP.1的比值也逐渐增高,表明其肝纤维化程度在逐渐加重,并且以结节型肝B超表现患者肝纤维化程度为最重.由于血清MMP-1、TIMP-1水平及TIMP-1/MMP-1的比值与WD肝脏B超分型具有一定的相关性,因此血清MMP-1、TIMP-1水平及MMP.1/TIMP.1的比值的高低可以反映WD肝损害在B超表现上的轻重不同,并能评估各B超类型WD患者的肝纤维化程度的轻重.本研究还通过对不同临床类型WD患者血清MMP-1、TIMP-1的比较及与临床类型相关性分析可以看出:脑一内脏型患者血清TIMP-1水平及血清TIMP-1/MMP-1的比值在最高,而血清MMP-1水平最低,表明脑一内脏型WD患者肝纤维化程度最重;
脑型患者血清TIMP-1水平及血清TIMP-1/MMP-1的比值在最低,而血清MMP-1水平最高,表明脑型WD患者肝纤维化程度较轻.此可能与WD患者体内铜沉着的病理生理过程及损伤脏器的重点不同有关.由于血清MMP-1、TIMP-1水平及TIMP-1/MMP-1的比值与WD临床分型有较好的相关性,因此血清MMP-1、TIMP-1及TIMP-1/MMP-1的比值测定可以反映肝损害的轻重及肝纤维化程度,对WD临床分型具有一定的指导意义.
总之,血清MMP-1、TIMP-1及TIMP-1/MMP-1的比值是反映WD肝纤维化程度的较好指标,这些指标水平与WD临床分型及B超分型有很好的相关性,特别是血清TIMP-1及TIMP一1/MMP一1的比值对动态观察WD肝纤维化演变过程、判断肝纤维化程度具有重要的临床意义.
（责任编辑：颜子力）
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