1.通过PCR扩增目的基因片段PCR要设计引物，设计引物时要选择合适的同源序列，根据质粒载体和基因序列要选择合适的酶切位点，PCR需始燃稳财损的产物要纯化。2.酶切根据环绍九边须套强么谁引物设计的酶切位点，分别对PCR产物和质粒载体进行酶切，酶切后的产物也要进行回收3.连接通过连接酶将酶切后照常的PCR产物和质粒载体进行连接4.转化将连接产物转化到受体菌中（一般为DH5a），涂板，培养过夜5.挑取单克隆，并鉴定挑去平板上的单克隆培养，可以通过PCR或者酶切初步鉴定阳性克隆，对初步鉴定出来的阳性克隆进行测序
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