底物水平磷酸化〔作用〕是指物质在生物氧化过程中，常生成一些含有高能键的化合物，而这些化合物可直接偶联ATP或GTP的合成，即物质在脱氢或脱水过程中，产生高能代谢物并直接将高能代谢物中能量转移到ADP(GDP)生成ATP(GTP)的过程。这种产生ATP等高能分子的方式称为底物水平磷酸化。
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