韧黏素-C的分解与早期肺癌的术后复发转移蔡铭谢宗涛翁鸢常庆常建华【摘要】目的探讨细胞外问质韧黏素一c(TN—c)的分解与非小细胞肺癌(NscI．c)术后复发的关系，以及TN—c分解的分子机制。方法收集63例I期NscLc患者的组织标本，以westemblot测定TN—c蛋白的表达，明胶酶谱法测定基质金属蛋白酶(MMPs)的活性。结果63例患者中，12例检测到TN—c的分解片段。有TN—c分解组肺癌组织与正常肺组织MMP-2活性之比为3．5±O．4，明显高于无TN．c分解组
(1．5±0．4，P0．001)。有无TN—c分解与肺癌的复发、转移有关，可检测到小分子TN—c片段者复发、转移率高(PO．001)。无TN—c分解患者的5年生存率为73．9％，高于有TN—c分解的患者(45．8％，尸=0．028)。无TN—c分解患者的4年和10年无复发生存率分别为8
2．1％和76．6％，高于有TN—c分解的患者(P0．001)。结论TN—c分解片段是NscLc术后复发、转移的有效指标，MMP．2可能是肺癌组织中分解TN—c的重要蛋白酶。【主题词】韧黏素一c；基质金属蛋白酶；非小细胞肺癌外科手术是治疗早期原发性肺癌的最有效方法，然而其术后5年生存率仅80％左右，近20％的患者死于肺癌的复发、转移。我们期望发现能预测早期肺癌复发、转移的标志物，从而使这部分患者能接受积极的辅助化疗，以改善其生存率。细胞外间质蛋白韧黏素一C(tenascin—c，TN—C)是细胞外基质的重要成分之一，在正常组织中弱表达，而强烈表达于恶性肿瘤发生及其他有组织重建的过程中，其功能与胎儿发育及肿瘤生成过程中的细胞间相互作用有关。高分子体形态的TN．c表达被认为是恶性肿瘤发展的显著性标志。我们检测了63例I期非小细胞肺癌(non—small—celllungcancer，NscLc)患者肺癌组织中TN—C分解的状况，并分析了刚一c分解与患者预后、基质金属蛋白酶活性的关系。资料与
方法1．临床资料：1989年8月一1998年12月，在我科接受标准的根治l生手术和常规肺门及纵隔淋巴结清扫术的63例I期NSCLC患者，男51例，女12例，年龄48～84岁，平均(65．3±8．2)岁。其中鳞癌35例，腺癌28例；在获得患者知情同意后，63例患者均术中取肺癌和正常肺组织，取出后立即用液氮冻结并保存于一80℃备用。
2．westemblot检测TN—C蛋白的表达：肺癌和正常肺组织中TN—C蛋白的提取采用Kusagawa等的方法。取100¨g组织提取物，经6％十二烷基硫酸钠．聚丙烯酰胺凝胶电泳(sDs—PAGE)后，采用增强化学发光(EcL)试剂盒(英国Amersham公司产品)检测TN—c杂交信号，感光胶片显影。
3．明胶酶谱法测定MMPs的活性：组织提取物经含1mg／ml明胶的10％SDS—PAGE电泳，在2．5％Triton—100洗脱液中洗涤lh，于底物缓冲液37℃下孵育18h，0．1％考马斯蓝R250染色后在脱色液(30％甲酸和10％乙酸)中脱色15min，采用凝胶成像仪扫描泳带。按照Davies等{3。的方法计算MMP一2的活性率。
4．随访：患者术后每l～3个月随访1次，随访时间为4～131个月，中位随访时问为62个月。随访内容包括：每3个月验血和胸片检查，每6个月行胸部或其他部位的CT扫描。
5．统计方法：生存期指手术日至死亡或终止随访的时问。无复发生存期是指手术日至术后第1次有复发证据或随访中止日仍无复发的生存时间。列联表资料采用x2检验，两组问均数比较采用student检验，采用Kelan—Meier法绘制生存曲线，组间生存率比较采用Logmnk检验，预后影响因素分析采用cox比例风险模型回归分析。显著性水平仅=0．05。结果
1．肺癌组织中TN．c蛋白的表达：在10例肺癌患者正常肺组织的杂交谱中，可分别见到相对分子质量为250000和190000的TN—c反应片段，但无相对分子质量190000的片段(图1)。在全部63例肿瘤组织中，皆可见到相对分子质量为250000和190000的片段，其中19．0％．(12／63)可见相对分子质量190000的片段，这些小分子片段我们暂考虑为TN—c被分解的产物(图2)；无TN—C分解者51例。
2．肺癌组织中MMPs的活性：潜活性MMP一2和活性MMP．2分别在相对分子质量为66000和62000图l正常肺组织中TN-c蛋白的表达1、2、5、6、8、9、10：无TN．c分解的患者；3、4、7：有TN．c分解的患者图2肺癌组织中TN—c蛋白的表达的位置形成代表性的条带，潜活性MMP．2存在于所有的肿瘤和正常组织中，并且肿瘤和正常组织中的活性相近；虽然活性MMP一2也可见于正常组织中，但肺癌组织MMP。2的活性率(45．5％±8．4％)明显高于相对应的正常组织(25．9％±10．5％，P=0．0083，图3)。肺癌组织与正常肺组织提取物均无MMP．7活性表达。活性MMP一9存在于所有的肺癌和正常组织中，肺癌和正常组织中MMP．9活性(灰度值)分别为32656±341和34892±284，未见明显差异(P=0．18)。3
a：有TN．c分解的NscLc患者；3
b：无TN—c分解的NscLc患者；T：肺癌组织；N：正常肺组织图3肺癌组织中MMP_2的活性
3．TN—C分解与MMP一2、MMP一9活性的关系：有TN—c分解组肺癌组织与正常肺组织MMP一2活性之比为3．5±0．4，明显高于无TN—c分解组(1．5±0．4，P0．01，图3)。有TN—C分解组和无TN—c分解组MMP-9的活性(灰度值)分别为37562±323和35854±278，两组间差异无统计学意义(P=0．14)。
4．TN—C分解与NscLC患者预后的关系：63例患者中，17例(26．9％)被证实有局部复发或远隔转移，其中同肺叶复发1例，相邻肺叶复发10例，纵隔淋巴结转移l例，骨转移2例，脑转移3例。TN—C分解与肺癌的复发、转移有关，可检测到小分子TN—c片段者复发、转移率高(Po．ol，表1)。cox回归分析结果显示，TN—c分解是肺癌复发的独立影响因素(DR=9．353，95％可信区间为3．447～2
5．376)，而患者的性别、年龄、组织学类型和手术方法与肺癌复发无关。表1TN—c分解与NscLC复发、转移的关系有TN—c分解和无TN—c分解患者的5年生存率分别为45．8％和73．9％(P=o．028，图4)。有TN—C分解患者的4年和10年无复发生存率分别为28．1％和O，而无TN．C分解患者的4年和lO年无复发生存率分别为82．1％和7
6．6％(P均0．01，讨论目前认为，肿瘤的复发、转移除了与肿瘤细胞本身的特性有关外，细胞外间质蛋白也起了重要作用。TN—C是含不同变形单体的糖蛋白一J，是重要的细胞外基质蛋白之一，相对分子质量约为190000～250000。研究表明，TN—C可由肿瘤细胞和肿瘤周围的问质细胞产生，有下调细胞黏附和促进上皮细胞迁移的作用。TN．c的结构中包含有一球状的纤维蛋白原样大片段的氨基末端、一个富含光氨酸的氨基末端及大量表皮生长因子样重复子和数个纤维结合素Ⅲ型重复子。这种独特的结构可能会赋予TN—c具有其他问质蛋白所没有的功能。较大的变体常突出地表现于一些肿瘤，如乳腺癌、前列腺癌、直肠癌等。也有研究显示，高分子量的TN．c显著表现于肺癌组织_2J。本研究结果进一步提示，小片段的TN—c分子高频率表达于复发肺癌患者中。MMPs是细胞问质分解的主要生理相关调节者。5j。Siri等M1研究表明，大分子TN—c能被MMP一7分解成相对分子质量分别为170000、65000和16000的3种分子片段，被MMP_2分解成相对分子质量分别为190000和120000的两种分子片段。本研究中，我们发现在肺癌组织中有两种相对分子质量分别为120000和80000的片段，可能是TN—C被分解的片段。Passliek等¨o报道，MMP-2在早期NscLc中过度表达，并与不良预后有关。因此，我们也检测了肺癌组织中MMP．2的活性，明胶酶谱法检测结果表明，NScLC肿瘤组织中的MMP-2活性显著高于相应的正常肺组织。本研究结果还表明，有TN—c分解组肺癌组织与正常肺组织MMP．2活性之比明显高于无TN—C分解组，提示高活性的MMP-2可以有效地将TN．c分解成小分子片段。虽然有研究表明MMP-7蛋白和mRNA高水平地表达于一些肺癌组织徊J，但我们采用caseinzmography法未能测出肺癌组织中MMP-7的活性。经检测MMP_9也表达于肺癌组织中，但未发现MMP．9的水平与TN—C的分解有关。相关的临床病理研究已揭示了TN．c表达与肿瘤转移的一些关系归10J。肺癌中的TN—C分解片段提示淋巴结转移的高频率表现旧J。TN—c分解片段的数目可能与MMP一2的活性有关，而MMP一2的活性与肿瘤组织的发展有关。但是，这些TN—C片段究竟仅仅是问质分解的产物，还是本身就有促进肿瘤侵袭转移的生物功能，目前尚不清楚。综上所述，有小分子TN—C片段表达的肺癌患者，其复发、转移的概率明显增高，表明小分子TN-c片段可用来作为预测肺癌术后复发转移潜力的标志物，对表达小分子TN．C片段的患者要给予积极的辅助化疗，进行密切随访。MMP．2的高活性与TN—C分解有关，肺癌中高活性的MMP-2可能是分解TN—C的蛋白酶。
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