植物基因组DNA提取试剂盒使用方法如下:
操作步骤:使用前先在漂洗液中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。
1、植物组织预处理:取新鲜植物组织(不超过100mg)或干重组织(不超过20mg),于液氮中充分研磨至细粉状,让液氮自然挥发。
2、将研磨好的植物组织粉末迅速转移到预先装有400ul溶液PA、20ul RNase A(10mg/ml)和5ul β-巯基乙醇的离心管中,充分颠倒混匀,室温放置10min。
3、加入140ul溶液PB,充分颠倒混匀,12000rpm离心10min,将上清转移至新离心管中(约400-500ul),注意不要吸入沉淀。
4、加入和上清相同体积的溶液PC,充分颠倒混匀,再加入和溶液PC相同体积的无水乙醇,此时若出现絮状物,将絮状物吹散后一起加入吸附柱中,12000rpm离心5min,弃废液,一次加不完可分两次加入。注意:如果吸附柱膜呈绿色或离心时有堵塞现象,可向吸附柱中加入600ul无水乙醇,并适当延长离心时间。
5、 向吸附柱中加入600ul漂洗液(请先检查是否已加入无水乙醇),12000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱放回收集管。
6、向吸附柱中加入600ul漂洗液,12000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱放回收集管中, 12000rpm离心2min。
7、将吸附柱置于室温或50℃温箱放置数分钟,否则残余的乙醇可能会影响后续的实验如酶切、PCR等。
8、将吸附柱放入一个干净的离心管中,向吸附膜中央悬空滴加50-200ul经65℃水浴预热的洗脱液,室温放置1-5min,12000rpm离心2min,即可得到高质量的植物基因组DNA。
9、(可选)离心所得洗脱液再加入吸附柱中,室温放置2min,12000rpm离心2min。
注意事项:
1、组织应尽量选取新鲜幼嫩样本,富含多糖多酚的组织可能会提取失败,请选用多糖多酚专用试剂盒。
2、如果试剂盒中的试剂出现沉淀,可在65℃水浴中融化,不影响使用。
3、洗脱缓冲液的体积不能小于50ul,DNA产物应-20℃保存。
动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒使用步骤如下:
操作步骤:
使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇,加入休积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。
1、样品的处理:
a、细胞:取1×106-1×107个悬浮培养细胞,12000rpm离心1min收集细胞,贴壁细胞先用胰蛋白酶消化处理,再用预冷的PBS吹打成细胞悬液,然后12000rpm离心1min收集细胞,尽量除去上清,加200ul溶液A,振荡至彻底混匀。
b、组织:组织量不宜过大,一般不要超过25mg,可以使用匀浆器匀浆,最好用液氮研磨成粉末状,再用预冷的PBS或无菌水充分悬浮,然后12000rpm离心1min收集细胞,尽量除去上清,加200ul溶液A,振荡至彻底混匀。
2、向悬浮液中加入20ul 的RNase A (10mg/ml),55℃放置15min。
3、加入20ul 的蛋白酶K( 10mg /ml ),充分颠倒混匀,55℃水浴消化,细胞消化时间较短,组织消化时间较长,一般需要1-3个小时才能完成(鼠尾需要消化过夜)。消化期间可颠倒离心管混匀数次,直至样品消化完全为止。消化完全的指标是:液体清亮及粘稠。
4、加入200ul体积溶液B,充分颠倒混匀,如出现白色沉淀,可放置于75℃ 15-30min,沉淀即会消失,不影响后续实验。如溶液未变清亮,说明样品消化不彻底,可能导致提取的DNA量少及不纯,还有可能导致堵塞吸附柱。
5、加入200ul无水乙醇,充分混匀,此时可能会出现絮状沉淀,不影响DNA的提取,可将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中。
6、12000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。
7、向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇), 12000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。
8、向吸附柱中加入600ul漂洗液,12000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。
9、12000rpm离心2min,将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR等。
10、将吸附柱放入一个干净的离心管中,向吸附膜中央悬空滴加50-200ul经65℃水浴预热的洗脱液,室温放置5min,12000rpm离心2min。
11、可将离心所得洗脱液再加入吸附柱中,12000rpm离心2min,即可得到高质量的基因组DNA。
注意事项:
1、试剂盒拆封后,RNase A和蛋白酶K需放置-20℃保存。
2、样品应避免反复冻融,否则会导致提取的DNA片段较小且提取量也下降。
3、如果试剂盒中的溶液出现沉淀,可在65℃水浴中重新溶解后再使用,不影响效果。
4、洗脱缓冲液的体积最好不少于50ul,体积过小会影响回收效率:洗脱液的pH值对洗脱效率也有影响,若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围),pH 值低于7.0会降低洗脱效率。
细菌基因组DNA提取试剂盒使用方法如下:
操作步骤:
使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶体上的标签。 所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。
1、取细菌培养液1ml,12000rpm离心1min.,尽量吸除上清。
2、向菌体中加入200ul溶液A,振荡或用移液器吹打使菌体充分悬浮(如果是革兰氏阳性菌,可在此步骤加入终浓度为20mg/ml的溶菌酶),向悬浮液中加入20ul的RNase A (10mg/ml),充分颠倒混匀,室温放置15-30min。
3、向管中加入20ul的蛋白酶K(10mg/ml),充分混匀,55℃消化30-60min,消化期间可颠倒离心管混匀数次,直至样品消化完全为止,此时可见菌液呈清亮粘稠状。
4、向管中加入200ul溶液B,充分颠倒混匀,如出现白色沉淀,可于75℃放置15-30min,沉淀即会消失,不影响后续实验。如果溶液未变清亮,说明样品消化不彻底,可能会导致DNA的提取量以及纯度降低,还可能堵塞吸附柱。
5、向管中加入200ul无水乙醇,充分混匀,此时还可能会出现絮状沉淀,不影响DNA的提取,可将溶液和絮状沉淀都加入到吸附柱中,静置2min。
6、12000rpm离心2min. 弃废液,将吸附柱放入收集管中。
7、向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前请先检查是否己加入无水乙醇)。12000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。
8、向吸附柱中加入600ul漂洗液, 12000rpm离心l min, 弃废液,将吸附柱放入收集管中。
9、12000rpm离心2min,将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,否则漂洗液中的乙醇会影响后续实验如酶切、PCR等。
10、将吸附柱放入一个干净的离心管中,向吸附膜中央悬空滴加50-200ul经65℃水浴预热的洗脱液,室温放置5min,12000rpm离心1min。
11、离心所得洗脱液再加入吸附柱中,室温放置2min ,12000rpm离心2 min,即可得到高质量的细菌基因组DNA。
注意事项:
1、样品应避免反复冻融,否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。
2、若试剂盒中的溶液出现沉淀,可在65℃水浴中重新溶解后再使用,不影响提取效果。
3、如果实验中的离心步骤出现柱子堵塞的情况,可适当延长离心时间。
4、洗脱缓冲液的体积最好不少于50ul,体积过小会影响回收效率;洗脱液的pH值对洗脱效率也有影响,若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围), pH值低于7. 0会降低洗脱效率。DNA产物应保存在-20℃,以防DNA降解。
5、 DNA浓度及纯度检测:得到的基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。 回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD260处有显著吸收峰,OD260值为1.0相当于大约50μg/ml双链DNA、40μg/ml单链DNA。OD260/0D280比值应为1.7-1.9,如果洗脱时不使用洗脱缓冲液,而使用去离子水,比值会偏低,因为pH值和离子存在会影响光吸收值,但并不表示纯度低。
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